Stedet, hvor San Sebastiano-katakomben står, var i oldtiden en dyb fordybning, der blev brugt som pozzolana-brud og kaldt ad catacumbas (eller “nær hulrummene”), et navn, der er blevet synonymt med en underjordisk kirkegård.

Siden det første århundrede er stedet blevet intensivt udnyttet og bygget: De underjordiske gallerier blev genbrugt til at få gravnicher, men på overfladen blev der bygget flere kolumbarier og mindst to boligsystemer (den såkaldte lille villa og den store villa) udstyret med bemærkelsesværdige billedlige vægdekorationer.

Omkring midten af det andet århundrede blev bunden af dalen begravet for at skabe en plads, hvor der på den ene side blev bygget tre mausoleer efter hinanden (af Clodius Hermes, af Innocentiores, af Ax).

En yderligere nedgravning af området blev foretaget for at give plads til opførelsen af triclia, en portikus omgivet af en mur, hvor adskillige graffiti påkaldelser rettet mod SS. Peter og Paulus, som blev æret sammen på dette sted omkring år 250.

På stedet lod kejser Konstantin (306-337) opføre en basilika i form af et romersk cirkus (kaldet “circiforme”).

I mellemtiden, allerede i det tredje århundrede, begyndte den katakombe, der husede martyrerne Sebastian og Eutichios grave, at udvikle sig under jorden.